Western blot 實驗技巧精要

——輕松獲得高質量 western blot 條帶圖

 

Western blot 方法在 SCI 文章中出現(xiàn)的頻率非常高，漂亮的 WB 電泳圖可以給文章增色不少。但是 WB 實驗的步驟瑣碎，細節(jié)頗多，要想得到令人滿意的結果還是需要花費很多時間和精力去摸索實驗技巧的。

 

小編經(jīng)過了一段時間的努力，已經(jīng)可以比較輕松的實現(xiàn)用 WB 方法對磷酸化蛋白計算藥物的 IC50 值（見下圖）。

    
 

接下來，小編將結合自己的經(jīng)驗以及網(wǎng)上可以搜索到的 WB 實驗技巧，為大家介紹一下 WB 實驗過程中的關鍵點。雖然 WB 實驗步驟很多，但只要抓中其中的幾個重點方面，就可以得到干凈、漂亮、清晰、客觀的電泳圖。

 

一、 樣品準備部分

小編認為，我們不應該太過重視 WB 電泳部分的操作技巧，樣品準備才是整個 WB 實驗中**重要的一個環(huán)節(jié)（沒有之一）。否則 WB 電泳技術再高也無法得到好的結果。小編認為以下 3 點值得大家重點關注：

 

1. 注意孵育、終止時間

如果想得到漂亮的梯度條帶，無論是不同處理時間的樣品，還是不同給藥濃度的樣品，在處理過程中都一定要嚴格按照設計的時間來孵育和終止，尤其是對于磷酸化蛋白，哪怕 1 秒也不要提前或耽擱。

 

2. 抑制蛋白降解

這是樣品制備中**需要注意的部分。抑制樣品蛋白降解的方法主要有兩種：

 

(1) 使用蛋白酶抑制劑

小編使用的是羅氏公司（Roche）的蛋白酶抑制劑 Cocktail 片劑，效果不錯。再與 PMSF 共同使用，可以很好地抑制蛋白降解。

 

(2) 全程低溫操作

提前預冷 PBS、裂解液甚**槍頭等，從收集細胞開始一直到煮樣的全過程都應該盡可能的保持在冰上操作。小編除了使用冰盒，大多數(shù)操作都是在 4℃冷房中進行的，雖然有點麻煩和辛苦，但是效果非常好。

 

3. 裂解液用量

將收集好的細胞加入裂解液進行裂解在操作上是非常簡單的，所以這一步的重要性很容易被大家忽視。裂解液的用量直接決定了細胞裂解程度以及裂解后的蛋白濃度。

 

如果加入的裂解液不足，蛋白濃度太高，會造成與上樣緩沖液反應不充分，電泳后會出現(xiàn)多條條帶，條帶形狀也不好。小編做磷酸化蛋白檢測時為了在每個膠孔中盡可能多上樣，所以用體積較少的裂解液制備了濃度很高的蛋白，結果就得不償失了（見下圖）。

 

這種情況的補救方法是給樣品繼續(xù)補加上樣緩沖液，煮樣，再跑膠。直接給已經(jīng)煮過樣的樣品補加上樣緩沖液再煮樣，跑膠后的效果也會好很多（見下圖）。

 

如果加入的裂解液過多，蛋白濃度太低，會導致在膠孔中的上樣量不足，條帶不清晰。

那么加入多少體積的裂解液**好呢？小編認為，加入細胞團體積的 10 倍體積的裂解液是一個比較好配比，當然也可以根據(jù)目標蛋白進行調(diào)整。

 

二、 WB 電泳部分

得到了高質量的樣品就已經(jīng)很接近成功了，小編接下來為大家介紹一些 WB電泳部分的注意事項。

 

1. 制膠

小編建議大家直接用制膠試劑盒，價格不貴，質量不錯。如果自己配置母液，就請注意 pH 值。

 

制膠部分**重要的是在配濃縮膠前不要著急將分離膠上面的水棄掉，先配好濃縮膠，在加 TEMED 之前再棄掉水。小編雖然沒有親自試過，但是如果棄掉水后 5 分鐘之內(nèi)還沒有加上濃縮膠，這塊膠**好還是不要用了。

 

2. 上樣

小編的經(jīng)驗是上樣的總蛋白量一般是 20-70ug，這個要根據(jù)檢測蛋白的含量而定，需要摸索。

 

計算后每個樣品的上樣體積如果比較小，用槍頭直接上樣是完全可以的，如果上樣量超過 20ul，**好還是用微量注射器來上樣。上樣確實是需要多多練習和體會的，上樣技術高可以多上 10ul 樣品而不溢出。

 

如果需要上樣的體積太大，也可以先上一部分，然后跑幾分鐘電泳，再停下來繼續(xù)上樣，這是完全可以的，經(jīng)過下一步的調(diào)整，是不會影響效果的。

 

3. 電泳

每個孔的上樣量參差不齊沒關系，在樣品還沒有達到分離膠時用≤60V 的電壓可以很好的將樣品排列整齊，不容易跑出弧線或者不齊的線。

 

當樣品達到分離膠后，通常會改成 100V 繼續(xù)電泳，小編認為如果時間充足，電壓低一點效果不錯。

 

請注意：電壓改一次就好，不要多次調(diào)整。

 

4. 轉膜

在轉膜環(huán)節(jié)小編認為**重要的，也是**容易被大家忽視的一步是：預冷電轉液。大家一定感覺到過，電轉液加入甲醇后溫度會迅速上升，所以建議跑上電泳就配電轉液，加入甲醇后放入 4℃冰箱預冷。#p#分頁標題#e#

 

當然，也不要忘了趕氣泡，趕氣泡時方向不要太隨意，也不要太用力，否則可能會使膠變形，尤其是邊緣部分，然后你的條帶就會……比較有藝術感了……（見下圖）

 

**后別忘了膜需要先在甲醇中浸泡一下，然后在電轉液中洗一洗再使用。

 

5. 封閉、一抗、二抗

很多 WB 技巧介紹都會根據(jù)曝光后的電泳圖的效果指出需要降低或提高一抗的稀釋倍數(shù)，延長或減少二抗孵育時間等等。小編認為只要按照說明書上推薦的比例做就沒有問題。出現(xiàn)各種條帶不好的情況，更大的可能是前面步驟中出現(xiàn)了問題，而不是這一步。

 

如果是用雜交袋進行一抗和二抗的孵育，小編建議大家在放入膜后，將雜交袋中的 TBS-T 趕出來，然后再加入一抗或二抗，這樣一抗和二抗就不會被膜上殘留的 TBS-T 稀釋了。

 

6. 曝光

當電泳圖上的條帶不夠好時，曝光相關參數(shù)也是經(jīng)常被認為是需要調(diào)整的部分。小編依然認為，曝光不是關鍵的步驟，前面做好了，曝光是很簡單的。小編用的是 ECL 發(fā)光液曝光法。這種方法**需要注意的就是 ECL 要在條帶上分布均勻。小編用的是普通自封袋，將膜放在一片自封袋上，加上發(fā)光液后，再蓋上一片自封袋，用手指趕一下，發(fā)光液就會比較均勻，效果不錯。

 

以上就是小編認為 WB 實驗中**需要注意的部分，相信做好以上內(nèi)容，做WB 實驗會成為一項樂趣。小編想再次提醒一下大家，樣品制備部分是非常重要的，拼技術和經(jīng)驗主要在這一部分。相比之下，WB 電泳部分雖然也有一定的技巧，但更多的是拼態(tài)度。小編很喜歡 WB 實驗，希望這些技巧能夠幫助您愛上western blot 實驗！