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電泳分離技術(shù)



電泳是帶電粒子在電場作用下的遷移。帶正電的粒子向陰極遷移，帶負電的粒子向陽極遷移。它們的遷移速率取決于電場強度，粒子（即分子）的凈電荷，大小和形狀以及分子在其中移動的介質(zhì)的離子強度，粘度和溫度。作為一種分析工具，電泳簡單，快速且靈敏度高。由于許多重要的生物分子（例如核酸和蛋白質(zhì)）都具有可電離的基團，因此它們在任何給定的pH值下都帶有電荷。因此，電泳是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中最廣泛使用的技術(shù)之一。

核酸由于其磷酸鹽主鏈而帶負電荷，因此會向陽極遷移。通過電泳分離核酸在支持基質(zhì)或“凝膠”中進行，最常用的是瓊脂糖或聚丙烯酰胺。通常，將凝膠澆鑄成薄板狀，并帶有用于裝載樣品的孔。將凝膠浸入電泳緩沖液中，電泳緩沖液提供離子以承載電流，并提供某種類型的緩沖液以將pH維持在相對恒定的值。載體基質(zhì)提供了按大小分離分子的方法，因為它們是多孔凝膠。多孔凝膠可以通過阻止或在某些情況下完全阻止大分子的移動，同時允許較小的分子自由遷移來充當(dāng)篩子。

瓊脂糖是從海藻中提取的多糖。通常以0.5％至2％的濃度使用。瓊脂糖濃度越高，凝膠“就越硬”。瓊脂糖凝膠具有較大的分離范圍，但分離能力較低。通過改變瓊脂糖的濃度，可以使用標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)分離約200至50,000 bp的DNA片段。聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺的交聯(lián)聚合物。聚合物鏈的長度取決于所用丙烯酰胺的濃度，通常在3.5％至20％之間。聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍很小，但分離能力非常高。對于DNA，聚丙烯酰胺用于分離小于約500 bp的片段。但是，在適當(dāng)?shù)臈l件下，單個堿基對長度不同的DNA片段很容易分辨。與瓊脂糖相反，聚丙烯酰胺凝膠被廣泛用于分離和表征蛋白質(zhì)混合物。

對于大多數(shù)DNA和RNA樣品，在瓊脂糖凝膠中進行電泳分離。由于磷酸鹽骨架，由于DNA或RNA的任何給定片段中每單位長度的電荷相同，因此所有樣品在施加電場的情況下都以相同的遷移率移向陽極。發(fā)生在瓊脂糖基質(zhì)中的分離是因為它可以阻止核酸的移動。最大的分子穿過凝膠孔的困難最大，而最小的分子移動沒有太大困難。這樣，凝膠電泳期間核酸的遷移率將取決于大小，最小的分子移動最快。

凝膠電泳后，需要對凝膠中的核酸進行染色和可視化。最常用的染色劑是熒光染料溴化乙錠。該分子插入核酸分子，可以在紫外線下觀察。凝膠顯示對應(yīng)于具有不同分子量的不同核酸分子群體的條帶。片段大小通常以“核苷酸”，“堿基對”或“ kb”（對于數(shù)千個堿基對）報告，具體取決于單鏈或雙鏈DNA是否已分離。通常通過與包含已知長度的線性DNA片段的市售DNA階梯進行比較來確定片段大小。

到目前為止，已經(jīng)討論過的通過電泳分離的核酸處于天然狀態(tài)。在這種情況下的電泳條件稱為非變性。當(dāng)要確定DNA序列或要確定RNA大小時，使用變性條件。DNA測序凝膠在變性劑（例如尿素和甲酰胺）的存在下運行，并且由于所分析的DNA分子較短，因此使用丙烯酰胺凝膠代替瓊脂糖。通過凝膠電泳確定RNA的大小需要用變性劑例如甲醛，乙二醛和甲基汞氫氧化物使RNA變性。

為了鑒定凝膠中特定核苷酸序列的存在，使用了一種稱為Southern印跡（如果正在分析DNA）或Northern印跡（正在分析RNA）的技術(shù)。在這兩種情況下，來自完整凝膠的DNA或RNA都將轉(zhuǎn)移到一塊硝酸纖維素膜或尼龍膜上。然后將膜暴露于雜交探針，即具有特定序列的單個DNA片段，要確定其在靶DNA（或RNA）中的存在。對探針DNA進行標(biāo)記，以便通?？梢酝ㄟ^引入放射性或用熒光或發(fā)色染料標(biāo)記分子來對其進行檢測。
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